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                                  學術進展 | PBJ:萬向元團隊利用基因編輯發現脂代謝區室(ZmPKSB-ZmTKPR1-1/-2)控制玉米花粉外壁形成

                                  花粉外壁(pollen exine)是主要由孢粉素(sporopollenin)組成的復雜脂質層,在保護雄配子正常發育以免受外界環境影響、保護花粉-柱頭互作以完成雙受精等多個生物過程中起到重要作用。孢粉素的合成需要大量脂代謝基因共同參與,同時為了能在短時間內快速合成大量孢粉素,位于同一代謝通路的脂代謝相關蛋白可能以代謝區室(metabolon)的形式發揮作用。目前,與擬南芥和水稻相比,克隆的玉米脂代謝核雄性不育(GMS)基因相對較少,同時玉米脂類GMS基因編碼的蛋白能否形成metabolon從而控制花粉外壁形成還尚未報道。

                                  2023年10月4日,北京科技大學生物農業研究院、伊犁師范大學生物育種產業研究院、北京中智生物農業國際研究院萬向元團隊在Plant Biotechnology JournalIF: 13.8)上在線發表了題為CRISPR/Cas9-based genome editing of 14 lipid metabolic genes reveals a sporopollenin metabolon ZmPKSB-ZmTKPR1-1/-2 required for pollen exine formation in maize 的研究論文。該研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術,批量化編輯突變14個玉米花藥特異表達的基因,從而鑒定出兩個玉米脂類GMS新基因 ZmTKPR1-1 和 ZmTKPR1-2 ;通過蛋白結構預測、分子對接、定點突變和生化分析等技術手段,在玉米花藥中首次發現了控制花粉外壁形成的ZmPKSB-ZmTKPR1-1/-2孢粉素代謝區室;并進一步解析了該代謝區室的調控通路和分子機制,為玉米花粉外壁孢粉素合成提供了新見解。

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                                  該團隊基于CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術,對14個在玉米花粉外壁形成關鍵階段(S8-S10時期)具有表達峰值的脂類基因進行定點突變,發現 ZmTKPR1-1 和 ZmTKPR1-2 為玉米GMS新基因。兩個基因單突變時僅造成輕微花粉敗育,但其雙突變體(tkpr1-1/-2)則表現為完全雄性不育(圖1a),且花粉外壁發育缺陷,因此,ZmTKPR1-1 和 ZmTKPR1-2 在雄花發育方面存在功能冗余,基因編輯技術突破了正向遺傳學難以發掘此類功能冗余基因的局限性。ZmTKPR1-1和ZmTKPR1-2均編碼四酮α-吡喃酮還原酶,首次被發現在內質網和細胞核中雙定位(圖1b);保守的催化位點(S128/130、Y164/166和K168/170)對其酶活性必不可少。qPCR和生化實驗表明轉錄因子ZmMYB84直接激活ZmTKPR1-1 和 ZmTKPR1-2 表達(圖1c-e)。

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                                  圖1. 轉錄因子ZmMYB84直接激活 ZmTKPR1-1 和 ZmTKPR1 的表達且其編碼的蛋白雙定位于內質網和細胞核

                                  已有研究表明參與脂類合成途徑的蛋白質,容易形成動態的蛋白復合體:即代謝區室(metabolon),從而高效地進行順序酶活反應(Nakamura, 2017)。鑒于團隊前期克隆的 ZmPKSB 基因(Liu et al,2022)與 ZmTKPR1-1/-2 在花藥發育過程中呈現相似的表達模式,其編碼蛋白同樣定位于內質網,且 pksb 突變體花粉外壁也明顯變薄,并基于蛋白分子互作模擬分析,最終推測它們可能會以蛋白復合體形式在孢粉素合成中發揮作用。進一步采用蛋白結構預測、分子對接、定點突變、體內體外生化分析等多種方法證明:上述3個蛋白彼此之間均可以產生互作并形成多酶復合物(圖2a, b),且以丙二酰輔酶A和中鏈脂肪酰輔酶為底物,進行高效地順序酶促反應以生成還原型四酮α-吡喃酮(圖2d)。由此,我們發現了首個存在于玉米花藥中的孢粉素代謝區室:即ZmPKSB-ZmTKPR1-1/-2。此外,還發現對于ZmPKSB-ZmTKPR1-2和ZmTKPR1-1-ZmTKPR1-2蛋白互作,分別有7個和4個氨基酸對接位點是必不可少的(圖2c)。


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                                  圖2. ZmPKSB、ZmTKPR1-1和 ZmTKPR1-1-2相互作用形成孢粉素代謝區室

                                  研究還發現,盡管 ZmPKSB 和 ZmTKPR1-1/-2 三者能形成孢粉素代謝區室,但它們突變后對花粉外壁和花藥角質層造成的影響卻不完全一致,如 tkpr1-1/-2 花粉外壁明顯薄于 pksb 突變體;tkpr1-1/-2 花藥外壁光滑,而 pksb 花藥角質層則更加致密(圖3a-b);相類似,在 pksb 和 tkpr1-1/-2 突變體花藥中,孢粉素、角質和蠟質相關基因的表達量以及角質、蠟質總含量和主要單體含量等也呈現明顯差異(圖3c),表明了植物花粉外壁形成過程中脂代謝途徑的復雜性。據此,提出了轉錄因子 ZmMYB84驅動的 ZmPKSB-ZmTKPR1-1/-2 孢粉素代謝區室調控玉米花藥和花粉發育的工作模型(圖3d),為研究植物脂類基因參與孢粉素、角質和蠟質合成與運輸提供了新思路。

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                                  圖3. ZmMYB84 驅動的 ZmPKSB-ZmTKPR1-1/-2 孢粉素代謝區室控制玉米花藥和花粉發育的工作模型

                                  北京科技大學生物農業研究院、伊犁師范大學生物育種產業研究院等單位安學麗教授、博士生張少偉江易林為該論文共同第一作者,萬向元教授為通訊作者。該研究得到了“十四五”國家重點研發計劃、國家自然科學基金、中央高?;究蒲袠I務費、北京市現代農業產業技術體系崗位科學家等項目的資助。感謝中國農業科學院蜜蜂研究所薛曉峰研究員在脂代謝產物測定工作上給予的幫助。


                                  參考文獻

                                  1.  Liu, X., Jiang, Y., Wu, S., Wang, J., Fang, C., Zhang, S., Xie, R., et al. (2022) The ZmMYB84-ZmPKSB regulatory module controls male fertility through modulating anther cuticle-pollen exine trade-off in maize anthers. Plant Biotechnol J, 20, 2342-2356.

                                  2. Nakamura, Y. (2017) Plant Phospholipid Diversity: Emerging Functions in Metabolism and Protein-Lipid Interactions. Trends Plant Sci, 22, 1027-1040.


                                  原文鏈接

                                  https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.14181








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