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                                  學術進展| Mol Plant:突破!萬向元團隊發現精準調控花粉外壁形成的“剎車分子”基因

                                  作者:Xiangyuan Wan

                                  花粉外壁是由孢粉素等精確組裝的多層結構,因耐高溫、防輻射、耐降解等特點,被稱為植物界的“鉆石”?;ǚ弁獗谠诨ǚ蹅鞑ミ^程中保護雄配子體,在花粉和柱頭識別過程中具有重要作用,決定受精能否成功進而影響籽粒產量?;ǚ弁獗诎l育缺陷導致的核雄性不育,可用于作物雜種優勢利用,提高作物產量。因此,花粉外壁一直是國內外的研究熱點。前人對花粉外壁圖案形成提出了相分離和自組裝模型[1,2]。然而,精確調控花粉外壁形成及厚度的分子機制仍然未知。

                                  2023年7月26日,北京科技大學生物農業研究院、北京中智生物農業國際研究院萬向元團隊在Molecular Plant上在線發表了題為ZmMS1/ZmLBD30-orchestrated transcriptional regulatory networks precisely control pollen exine development的研究論文。

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                                  https://doi.org/10.1016/j.molp.2023.07.010

                                  該研究利用上世紀30年代發現的第一個玉米雄性不育ms1突變體,經過11努力,克隆了玉米花藥特異表達的雄性不育基因ZmMs1(編碼LBD轉錄因子ZmLBD30),借助ms1突變體花粉外壁異常變厚的獨特表型(植物界之前發現的核雄性不育基因,都導致花粉外壁變?。?,綜合利用遺傳學、細胞學、生物技術、分子生物學、蛋白生化、多組學等技術,揭示ZmMS1/ZmLBD30作為花粉發育中第一個發現的反饋調控抑制子(“剎車分子”),通過反饋抑制其上游的轉錄激活鏈,形成反饋抑制調控環(ZmbHLH51-ZmMYB84-ZmMS7- ZmMS1/ZmLBD30),調節花藥絨氈層PCD和降解的時長,確?;ǚ弁獗诘逆叻鬯剡m時和適量形成;最終破解了花粉外壁厚度精準形成的未解之謎,取得了花粉發育和雄性不育生物學研究領域的突破性進展。

                                  該團隊篩選利用花粉外壁異常增厚的玉米雄性不育突變體ms1-alb,克隆了ZmMs1/ZmLBD30基因,其在花藥發育的單核小孢子(S9和S9-10)時期的絨氈層中特異表達。利用玉米花藥特異啟動子p5126驅動ZmMs1,創制了ZmMs1提前表達的遺傳材料p5126-ZmMs1,發現早表達ZmMs1能導致玉米顯性雄性不育。與野生型相比,ms1-alb花藥絨氈層降解延遲而p5126-ZmMs1降解提前;ms1-alb花粉外壁顯著增厚而p5126-ZmMs1明顯變?。▓D1)。因此,初步判斷ZmMS1/ZmLBD30是絨氈層細胞降解和花粉外壁發育的一個負調控因子。

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                                  圖1. ZmMS1/ZmLBD30調控花藥絨氈層降解和花粉外壁厚度

                                  玉米花藥全時期轉錄組分析發現,本實驗室之前報道的3個雄性不育轉錄因子基因ZmbHLH51、ZmMYB84ZmMs7[3,4],在花藥發育S9時期與ZmMs1有共同表達峰,qPCR及突變體遺傳分析表明ZmbHLH51、ZmMYB84和ZmMS7在花藥發育進程中形成級聯轉錄激活通路ZmbHLH51-ZmMYB84-ZmMS7,共同激活ZmMs1表達。Pro-LUC實驗表明ZmMS1/ZmLBD30是轉錄抑制子,顯著抑制ZmbHLH51、ZmMYB84ZmMS7表達。SELEX實驗揭示ZmMS1結合由13個堿基組成的CCGNNNNNNNCGG核心基序,而在ZmbHLH51、ZmMYB84ZmMs7啟動子上均包含該基序。ChIP-seq/qPCR、EMSA、突變體基因表達分析都顯示ZmMS1/ZmLBD30直接結合這3個基因的啟動子序列并抑制其表達。因此,ZmMS1受上游級聯激活通路誘導表達后分別反饋抑制上游3個轉錄激活子,形成反饋抑制環ZmbHLH51-ZmMYB84-ZmMS7-ZmMS1(圖2),ZmMS1/ZmLBD30被稱為上游級聯激活通路的“剎車分子”。該發現對花粉發育研究中報道的所謂“自抑制”現象提供了一種合理解釋,如擬南芥AtMs1ZmMs7同源基因)在atms1中的上調表達[5];本研究ZmMYB84myb84突變體中表達上調,ZmMs7ms7突變體中表達上調,因為myb84ms7突變,不能激活翻譯下游反饋抑制子ZmMS1,進而缺少對ZmMYB84ZmMs7轉錄抑制,導致ZmMYB84ZmMs7表達上調。這是本研究發現的最大亮點之一。

                                  進一步分析發現孢粉素合成、轉運相關ZmMs26、ZmABCG26等6個代表基因以及ROS清除相關ZmPODa等3個代表基因在ms1-alb中上調,而在p5126-ZmMs1中顯著下調。ChIP-Seq及體外表達調控分析均表明,這些基因直接受ZmMS1抑制或直接受ZmMYB84、ZmMS7激活進一步被ZmMS1間接抑制。據此,ZmMS1/ZmLBD30分子調控機逐漸明析:在ms1-alb突變體中,一方面孢粉素合成、轉運相關基因不能及時被抑制而產生過量的孢粉素;另一方面ROS清除基因不能及時被抑制,ROS含量不足以引發絨氈層PCD而導致絨氈層延遲降解,進而為合成更多的花粉外壁形成所需物質提供場所和時間,最終導致ms1-alb花粉外壁變厚。反之,提前表達ZmMs1則導致花粉外壁變?。▓D2)。ZmMs1在花粉發育至游離小孢子期被原本促進花粉外壁形成的ZmbHLH51-ZmMYB84-ZmMS7轉錄激活鏈激活表達,盡管ZmMS1表達的時間窗口非常窄,但ZmMS1蛋白一旦形成,立即開始同時反饋抑制ZmbHLH51、ZmMYB84 和ZmMs7基因表達,促進啟動絨氈層PCD和降解并關閉孢粉素合成、轉運等相關基因表達。因此,ZmMS1/ZmLBD30作為“剎車分子”及時高效終止花粉外壁物質的過度供應,平衡花粉外壁形成的適度時長和物質供應,確保外壁的正常厚度,體現了生命體精準調控的神奇魅力。這是本研究發現的又一大亮點。

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                                  圖2. ZmMS1/ZmLBD30反饋抑制上游轉錄激活子ZmbHLH51、ZmMYB84和ZmMS7精確調控花粉外壁形成

                                  最后,對ZmMs1在開花植物中的進化保守性進行了探索。共線性和序列比對分析表明,在玉米進化親緣關系較近的高粱、南荻中存在ZmMs1同源基因,且高粱中的同源基因可形成類似的反饋抑制環SbbHLH51-SbMYB84-SbMS7-SbMS1。但在進化關系較遠的植物中則缺失ZmMs1同源基因,例如水稻和擬南芥ZmMs1序列比對分值最高的基因敲除后均雄性可育。但是,ZmbHLH51、ZmMYB84和ZmMS7在水稻和擬南芥中的同源蛋白可形成類似的級聯激活通路OsTDR1-OsMYB80-OsPTC1和AtAMS-AtMS188-AtMS1,且這些同源基因的表達在水稻、小麥、擬南芥游離小孢子期之后均迅速下調,暗示可能存在類似于玉米ZmMS1 “剎車分子”。據此推測可能在水稻、擬南芥等植物中其它LBD基因發揮類似于ZmMs1的功能。通過兩個物種中LBD家族轉錄抑制子篩選,分別找到花藥表達的轉錄抑制子OsLBD37-like和AtLBD42,二者對OsTDR1-OsMYB80-OsPTC1和AtAMS-AtMS188-AtMS1激活通路分別具有抑制作用。利用水稻、擬南芥自身p5126啟動子驅動的pOs5126-OsLBD37-likepAt5126-AtLBD42轉基因水稻和擬南芥,均表現出顯性雄性不育,表型與p5126-ZmMs1轉基因玉米一致(圖3),表明水稻和擬南芥中也存在類似于玉米中ZmMS1/ZmLBD30主導的反饋抑制調控通路。因此,本研究的發現在不同植物中具有普適性,為相關領域科研工作者未來深入解析花藥和花粉發育的分子機制提供新的設計思路。這也是本研究發現的一大亮點。

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                                  圖3. ZmMS1/ZmLBD30在開花植物中的功能保守性及進化分析

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                                  北京科技大學生物農業研究院侯全璨、安學麗、馬彪、吳鎖偉和魏珣為該論文共同第一作者,萬向元為通訊作者。山東農業大學付道林、倪飛以及上海師范大學楊仲南參與了該項工作。該研究得到了“十四五”國家重點研發計劃、國家自然科學基金、中央高?;究蒲袠I務費、北京市科技新星等項目的資助。


                                  通訊作者簡介

                                  萬向元,北京科技大學生物農業研究院院長、二級教授、博導,教育部長江學者特崗教授,國家“萬人計劃”領軍人才,北京市特聘專家,“十四五”國家重點研發專項首席科學家。主要從事玉米雄性不育、綠色高效生物育種與遺傳基礎研究;已在PNAS、Mol Plant、Nat Com、Cell Res、PBJ、JAR、JCLP等國內外期刊發表論文132篇;參與出版教材和專著5部;授權發明專利33項;以第一完成人獲北京市技術發明獎一等獎、中國專利銀獎、“科創中國”先導技術等省部級科研和論文獎12項。兼任中國作物學會常務理事、中國生物工程學會常務理事、Crop Journal副主編等。


                                  招才引智


                                  北京科技大學生物農業研究院于2023年4月正式升級成為學校獨立的二級單位,下設5個優勢互補、上下聯動、相互賦能的研究中心:植物基因研究中心、生物育種研究中心、智慧農業研究中心、食物營養研究中心和可持續農業與生物經濟研究中心。根據研究院發展需要,現面向國內外公開招聘基因編輯、生物大數據分析、作物遺傳育種、食品營養與健康、農業可持續發展和生物經濟等領域高層次人才、優秀青年教師及博士后研究人員。有意者請將個人簡歷發送至:nongye@ustb.edu.cn,詳情請參見https://nongye.ustb.edu.cn/。


                                  參考文獻
                                  1、Radja, A.; Horsley, E.M.; Lavrentovich, M.O. and Sweeney, A.M. Pollen cell wall patterns form from modulated phases, Cell, 2019, 176: 856-868.
                                  2、Radja A. Pollen wall patterns as a model for biological self-assembly, J. Exp. Zool. (Mol. Dev. Evol.). 2020, 1-13.
                                  3、An, X.; Ma, B.; Duan, M.; Dong, Z.; Liu, R.; Yuan, D.; Hou, Q.; Wu, S.; Zhang, D.; Liu, D.; Yu, D.; Zhang, Y.; Xie, K.; Zhu, T.; Li, Z.; Zhang, S.; Tian, Y.; Liu, C.; Li, J.; Yuan, L. and Wan, X. Molecular regulation of ZmMs7 required for maize male fertility and development of a dominant male-sterility system in multiple species, PNAS, 2020, 117: 23499-23509.
                                  4、Jiang, Y.; An, X.; Li, Z.; Yan, T.; Zhu, T.; Xie, K.; Liu, S.; Hou, Q.; Zhao, L.; Wu, S.; Liu, X.; Zhang, S.; He, W.; Li, F.; Li, J. and Wan, X. CRISPR/Cas9-based Discovery of Maize Transcription Factors Regulating Male Sterility and Their Functional Conservation in Plants, Plant Biotechnol. J., 2021, 19: 1769-1784.

                                  5、Yang, C.; Vizcay-Barrena, G.; Conner, K. and Wilson, Z. A. MALE STERILITY1 is required for tapetal development and pollen wall biosynthesis. The Plant Cell, 2007,19: 3530-3548.
















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